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麥角生物堿 固相凈化柱柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

介紹:

麥角菌核是以麥角suan為基本結(jié)構(gòu)的一系列生物堿衍生物，如麥角新堿、麥角an、麥角克堿、麥角毒堿、麥角生堿、麥角辛、麥角隱亭、麥角考寧及它們的差向異構(gòu)體等。被麥角菌污染的谷物研磨加工成面粉后通常含有高濃度的麥角堿。攝食受污染的食品或飼料可能對人和動物產(chǎn)生嚴(yán)重影響。多量致病，少量治病，麥角堿亦可作為藥用，適用于子宮、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管。

背景:

在食品方面的研究領(lǐng)域中，對麥角生物堿的研究，常見的方法有:比色分析法(Colorimetry)，但此方法只適合總堿含量測定，不能區(qū)分麥角生物堿的差向異構(gòu)體;薄層色譜分析法(Thinlayerchromatography,TLC)分析方法簡便、快速、成本低，但靈敏度低、重現(xiàn)性差，因此目前多用于定性分析及半定量分析;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，具有檢測時間短、特異性強(qiáng)、儀器設(shè)備和樣品前處理簡單的特點(diǎn)，適用于大批量樣品篩查與現(xiàn)場檢測，然而也存在酶標(biāo)記抗體保存時間有限且用量大，交叉反應(yīng);氣相色譜法

( Gas Chromatography，GC)一般要求被分析物在一定溫度下易氣化且在氣化溫度下較穩(wěn)定。采用GC檢測肽型麥角生物堿時，肽型麥角生物堿在進(jìn)樣口溫度(250~300℃)下不穩(wěn)定、易分解，肽型麥角生物堿會發(fā)生熱分解，產(chǎn)生縮氨酸部分。利用質(zhì)譜法(Mass spectrometer,MS)可以區(qū)分肽型麥角生物堿和其他麥角生物堿，但對于肽型麥角生物堿的差向異構(gòu)體，如:麥角an和麥角an寧，則不能進(jìn)行區(qū)分;高效液相色譜分析法(Highperformance liquid chromatography,HPLC),該方法具有分析效率高、重現(xiàn)性好、專一性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是目前常用的一種麥角生物堿的檢測方法，該方法不宜鑒定新化合物、區(qū)分特征麥角生物堿及其異構(gòu)體;綜合來說，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)應(yīng)用廣泛，這種方法能定量分析麥角生物堿的同時確定麥角生物堿的相對分子質(zhì)量，還可能得到新的化合物。本方案參考 GB 2715-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)糧食》采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。

1.儀器設(shè)備

1.1.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀

1.2.離心機(jī):轉(zhuǎn)速能達(dá)到10000r/min。

1.3.超聲波/斡旋混合或搖床。廠家:Pribolab 型號:DMT-2500

1.4.分析天平:0.01g。

1.5.泵流操作架。廠家:Pribolab

1.6.固相凈化柱。廠家:Pribolab

2.實(shí)驗(yàn)過程

2.1. 提取與分離純化

提取粉碎樣品后，稱取4g于50mL離心管中，加入20mL 乙腈-碳酸銨混合溶液(84/16,v/v),振蕩提取30 min,4℃,10000r/min，離心10 min,上清液過濾，待純化。純化取4mL濾液加入試管中，將試管緩慢推入Pribolab®MFC333麥角生物堿固相凈化柱，直至試管底部，量取凈化柱管內(nèi)洗脫液 0.5 mL于另一試管中，再加入0.5mL碳酸銨溶液(3 mmol/L)，混合均勻，通過微孔濾膜(0.2 μm)過濾至進(jìn)樣小瓶，待上機(jī)分析測定。

2.2.測定

2.2.1.液相色譜條件

色譜柱:Gemini-NX 3u C18 ( 100 mm x2.0 mm) (i.d. )，3 μm )

液相色譜柱或相當(dāng)者。

流動相:A-乙腈，B-碳酸銨溶液(3 mmol/L)。

柱溫:30℃。

流速:0.3 mL/min.

進(jìn)樣量:5 μL.

梯度洗脫條件見表1.

2.2.2.質(zhì)譜條件

電離方式:電噴霧電離(ESI)。

掃描方式:正離子掃描。

電噴霧電壓、離子源溫度、霧化氣、輔助氣、氣簾氣和碰撞氣均為高純氮?dú)?，使用前?yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求。

監(jiān)測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。

結(jié)論:

本文以乙腈-碳酸銨混合溶液(84/16，v/v)提取樣品，Pribolab 固相凈化柱凈化，經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分離檢測后，可同時測定小麥中多種麥角生物堿。實(shí)驗(yàn)通過對檢測條件、樣品前處理過程及固相凈化手段的優(yōu)化，使得該方法應(yīng)用于小麥基質(zhì)中均能得到較好的回收效果及重現(xiàn)性。本方法操作簡單、可行性強(qiáng)、回收率高、結(jié)果準(zhǔn)確、檢出限低，方法學(xué)各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均滿足定性、定量分析要求，適用于小麥中麥角生物堿的測定。